کشت بافت
تعریف کشت بافت
به کشت قطعه ای از بافت گیاه در شرایط آزمایشگاهی و کاملا استریل، کشت بافت یا کشت درون شیشه ای(invitro) می گویندکه در نهایت از این قطعه ، یک گیاه کامل به دست می آید.اصطلاح invitro در برابر اصطلاح invivo (کشت در فضای آزاد) می باشد.
تاریخچه کشت بافت: سابقه کشت بافت حدودا به یک قرن پیش باز می گرددو اساس کشت بافت به تئوری شیلدن و شوان مربوط می شود. بر اساس این تئوری، هر سلول از موجود زنده اگر در شرایط مطلوب قرار گیرد ، به یک گیاه کامل تکامل می یابد. این خاصیت Toti potency نامیده می شود.بعد از آن دانشمندان بر اساس همین تئوری به موفقیت هایی دست یافتند.
اهمیت و کاربرد کشت بافت در باغبانی[ویرایش]
۱)تولید گیاهان عاری از ویروس و بیماری.
۲)تکثیر و ریز ازدیادی گیاهان (Micropropagation) .
۳)تولید گیاهان هاپلوئید و سپس دیپلوئید کاملا هموزیگوس از طریق کشت میکروسپور یا بساک.
۴)دست ورزی ژنتیکی و دورگ گیری سوماتیکی با استفاده از الحاق پروتوپلاسمی و همچنین ایجاد تلاقی بین گونه ای در شرایط درون شیشه ای.
۵)کشت سوسپانسیون سلولی و تولید متابولیت های اولیه مثل قند وکربن و نیز متابولیت های ثانویه.
۶)ایجاد گیاهانی با خصوصیات جدید با استفاده از تنوع سوماکلونال.
۷)نجات جنین با استفاده از کشت جنین های نارس در تلاقی بین گونه ای.
۸)نگهداری ژرم پلاسم گیاهان در شرایط درون شیشه ای.
۹)استفاده از کشت بافت در انتقال ژن به گیاهان.
۱۰)استفاده در مطالعات بافت شناسی ، سلول شناسی ، و فیزیولوژی گیاهی .
انواع کشت بافت[ویرایش]
• کشت بذر
• کشت جنین
• کشت کالوس
• کشت اندام ( برگ ، ریشه ، ساقه ، مریستم و دانه گرده )
• کشت سوسپانسیون سلولی
• کشت پروتوپلاست
محیط کشت[ویرایش]
(Medium)
در شرایط آزمایشگاهی به اولین چیزی که نیاز داریم یک بستر مناسب برای رشد گیاه می باشد ، به این بستر اصطلاحا محیط کشت می گویند.در محیط کشت کلیه مواد غذایی زیر وجود دارد:
عناصر ماکرو
عناصر میکرو
هیدرات های کربن یا قند ها
ویتامین ها
هورمون ها
اسید های آمینه همچون گلایسین و ترکیبات پیچیده مثل پپتون
هیدرولیزات کازئین
شیر نارگیل
پلی آمین
آگار
آب
عناصر ماکرو: این مواد به مقداری بیش از ۰.۵ میلی مول بر لیتر ، مورد نیاز گیاه می باشند. این عناصر شامل :Ca , MgSN , P , K , می باشند. معولا عناصر معدنی ماکرو به صورت استوک ساخته و در یخچال نگهداری می شوند. در تهیه استوک باید دقت شودکه مواد ترکیب شده ، تشکیل رسوب ندهند. به عنوان مثال در بین عناصر ماکرو، منیزیوم را معمولا به صورت استوک جداگانه تهیه می کنند.
برخي كاربردهاي كشت بافت گياهي در ادامه، برخي از مهمترين كاربردهاي كشت بآفت گياهي و فوايد اقتصادي آنها مورد بررسي قرار مي‌گيرد:
لاين‌هاي دابل‌هاپلوئيد (Double haploids) از طريق كشت اندام‌هاي هاپلوئيد (دانه گرده، بساك، پرچم و غيره) و يا توسط تلاقي‌هاي بين‌گونه‌اي و بين‌جنسي (روش حذف كروموزومي) توليد مي‌شوند.
اين روش، طول دوره به‌نژادي را از حدود ۱۲-۱۰ سال (در برنامه‌هاي به‌نژادي سنتي و كلاسيك) به ۷-۶ سال كاهش مي‌دهد و لاين‌هاي صددرصد خالص (هموزيگوس) ايجاد مي‌نمايد. بنابراين روش دابل‌هاپلوئيدي مي‌تواند سريع‌تر از روش‌هاي سنتي، رقم جديد را معرفي نمايد.
توليد رقم‌هاي دابل‌هاپلوئيد در گندم، جو، برنج، كلزا، ذرت، نيشكر، سويا، انگور و سيب گزارش شده است. در چين رقم‌هاي جديد برنج دابل‌هاپلوئيد حاصل از كشت دانه گرده و بساك در سطح ميليون‌ها هكتار كشت مي‌شوند. در فرانسه نيز دو رقم كلزا كه به طور غالب كشت‌وكار مي‌شوند و يك رقم گندم و همچنين در كانادا دو رقم جو از اين طريق توليد شده‌اند.
در ايران نيز چندين لاين اميدبخش گندم دابل‌هاپلوئيد از طريق روش حذف كروموزومي (تلاقي گندم x ذرت) توليد شده است كه احتمال مي‌رود در سال‌هاي آينده به عنوان رقم جديد معرفي شوند.
۲- ريزازديادي و تكثير انبوه گياهان
ريزازديادي (Micropropagation) و تكثير سريع و انبوه ژنوتيپ‌هاي مطلوب و توليد گياهان يكسان (Clone propagation) عاري از بيماري (به‌خصوص عاري از ويروس‌ها) از طريق كشت بآفت و اندام‌هاي مختلف گياهي در بسياري از گياهان مهم اقتصادي امكان‌پذير مي‌باشد. به‌عنوان مثال مي‌توان به توليد سريع و انبوه سيب‌زميني، خرما، موز، نخل روغني، توت‌فرنگي، سيب، مارچوبه و نيشكر از گياهان زراعي و باغي؛ اوكاليپتوس و سپيدار، از درختان جنگلي و رز، اركيده، ميخك، داودي، شمعداني، ژربرا، ديفن‌باخيا، دراسنا، بنفشه آفريقايي، آنتوريوم، كوكب، انجيرزينتي (فيكوس)، فيلودندرون و سينگونيوم از گل‌ها و گياهان زينتي اشاره نمود.
اين روش علاوه بر تكثير سريع و توليد گياهان عاري از عوامل بيماريزا، در اكثر گياهان چندساله از جمله خرما و گردو باعث كاهش دوره نونهالي و زودباردهي آنها مي‌شود. همچنين فضاي بسيار كمتري براي تكثير نياز مي‌باشد.
پيرتروم حشره‌كشي طبيعي است كه از گل‌هاي خشك نوعي از گياه داودي (Charanthemum cineraiaepolium) به دست مي‌آيد. كشور كنيا بزرگترين توليدكننده آن مي‌باشد كه تجارت سالانه آن از طريق ريزتكثيري حدود ۷۵ ميليون دلار مي‌باشد.
طي يك دوره هشت‌ماهه، از يك غده سيب‌زميني عاري از ويروس حاصل از كشت مريستم انتهايي، تعداد ۲ ميليارد غده سالم يكسان در يك مساحت ۴۰ هكتاري بدست آمد. اين سرعت تكثير ۱۰۰ هزار برابر بيشتر از سرعت توليد مثل جنسي است.
يك نخل روغني توسط كشت يك قطعه از بآفت برگ توانست طي يكسال حدود ۵۰۰ هزار گياه يكسان مقاوم به فيلاريوسيس با توليد روغن ۶ تن در هكتار را تامين كند (اين مقدار روغن ۳۰-۶ برابر بيشتر از ساير گياهان اصلي توليد كننده روغن مانند آفتابگردان و سويا مي‌باشد). همين روش براي تكثير رقم‌هاي جديد نارگيل نيز به كار مي‌رود. كشت مريستم انتهايي و يا جوانه‌هاي جانبي و توليد و تكثير گياهان عاري از بيماري و ويروس در بيش از ۵۰ نوع گياه شامل سيب‌زميني، توت فرنگي، انگور، ليمو، كاساوا، سيب‌زميني شيرين، موز و غيره امكان‌پذير مي‌باشد.
۳- تنوع سوماكلونال
القاي تنوع رويشي يا سوماتيكي (Soamaclonal variation) با هدف ايجاد تنوع جديد و يا انتخاب تنوع موجود و گزينش ژنوتيپ‌هاي مطلوب (مقاومت به تنش‌هاي زنده و غيرزنده، كيفيت بهتر و غيره) در درون محيط‌كشت (Invitro selection) انجام مي‌شود.
كشت سلول‌ها و بافت‌هاي گياهي در محيط‌كشت مصنوعي و در شرايط خاص باعث بروز تغييرات ژنتيكي در آنها مي‌شود. بنابراين جهت ايجاد تنوع و انتخاب گياهان واجد صفات تغييريافته و جديد از قبيل گياهان مقاوم به شوري، خشكي، گرما، سرما و مقاومت به آفات و بيماري‌ها و يا بهبود كيفيت مواد غذايي از اين روش‌ها استفاده گرديده است كه در بعضي از زمينه‌ها، رقم‌هاي تجاري نيز توليد شده است. طي دهه اخير نيز اين گونه پژوهش‌ها با شدت بيشتر دنبال مي‌شود. با توجه به وجود اكثر مشكلات فوق در كشور، بكارگيري اين فنون در ايران نيز مي‌تواند پتانسيل اقتصادي قابل توجهي به دنبال داشته باشد.
از ايجاد رقم‌هاي جديد تجاري توسط تنوع سوماكلونال مي‌توان به موارد زير اشاره نمود:
- گوجه‌فرنگي داراي رنگ، طعم و بآفت عالي كه مي‌تواند ۱۴-۱۰ روز پس از برداشت (بدون آسيب) نگهداري شود.
- فلفل شيرين با اندازه ريز، بدون دانه، تغيير درجه شيريني و رنگ قرمز تيره از طريق كشت بساك به مرحله تجاري رسيده است.
- رقم‌هاي هويج و كرفس تردتر و شيرين‌تر به بازار عرضه شده است.
- يك رقم برنج ديررس و يك رقم پاكوتاه در ژاپن بدست آمده است.
- لاين‌هاي متحمل به شوري در برنج ايجاد شده است.
- توليد رقم‌هاي تجاري داراي صفات مطلوب در سيب‌زميني، نيشكر، برنج، ذرت، جو، گندم، تنباكو، شبدر، يونجه، كلزا، يولاف و گوجه‌فرنگي نيز از اين روش گزارش شده است.
۴- دورگ‌گيري سوماتيكي و امتزاج پروتوپلاست
دورگ‌گيري سوماتيكي (Somatic hybridization) و امتزاج پروتوپلاست (Protoplast Fusion) در جنس‌ها و گونه‌هايي انجام مي‌شود كه تلاقي‌پذيري ندارند. اين كار به منظور دستكاري گونه‌هاي گياهي و در جهت افزايش تنوع ژنتيك و ايجاد صفات و يا گياهان جديد و توليد سيبريدها (دورگ‌هاي سيتوپلاسمي) استفاده مي‌شود. اين فنون با رفع محدويت تلاقي‌هاي بين‌گونه‌اي و بين‌جنسي از طريق كشت تخمك نارس يا بالغ، گرده‌افشاني در محيط مصنوعي (Invitro Pollination) و يا بكارگيري فنون نجات (يا كشت) جنين (Embryo rescue) مي‌توانند به عنوان مكمل روش‌هاي اصلاح سنتي عمل نمايند.
اگرچه به‌نژادگران اميدواري زيادي به اين فنون دارند، ولي تاكنون موفقيت كاربردي چنداني نداشته است. از جمله صفاتي كه در اين روش براي انتقال مورد توجه هستند، مي‌توان تحمل به تنش‌هاي محيطي از قبيل سرما، شوري، خشكي و مقاومت به آفات و بيماري‌ها را نام برد.
ايجاد دورگ‌هاي سوماتيكي به روش امتزاج پروتوپلاست در بيش از ۳۰ گونه و ۱۲ جنس انجام شده است. پوميتو (Pomato) تنها گياه جديدي است كه از طريق امتزاج پروتوپلاست گوجه‌فرنگي و سيب‌زميني توليد شده است ولي هنوز بهره‌برداري كشاورزي ندارد.
۵- توليد متابوليت‌هاي ثانويه (Secondary metabolites)
گياهان در طول زندگي خود برخي از مواد آلي شيميايي پيچيده توليد مي‌كنند كه در رشد و نمو و فعاليت‌هاي حياتي گياه نقشي ندارند و به آنها متابوليت‌هاي ثانويه گفته مي‌شود. مواد معطر، مواد موثره دارويي، فرمون‌ها، حشره‌كشها، علف‌كش‌ها، قارچ‌كش‌ها، هورمون‌هاي گياهي و مواد آللوپاتيك (ايجاد كننده انواع مقاومت‌ها و يا بازدارنده رشد و نمو) از اين جمله هستند (جدول۴). توليد انبوه و سريع اين مواد پيچيده در مقياس زياد از روش‌هاي شيميايي آزمايشگاهي، مشكل و يا غيرممكن مي‌باشد. از سوي ديگر، به دليل گسترش مصرف مواد دارويي و صنعتي، نياز به مواد جديد با تاثيرات بيشتر از منابع متنوع تجديدشونده شيميايي با عوارض زيست محيطي كمتر و روش‌هاي استخراج آسان و اقتصادي ضروري مي‌باشد. بيوتكنولوژي و از جمله كشت بافت‌هاي گياهي براي توليد آسان و انبوه متابوليت‌هاي ثانويه، يك راه‌حل مناسب و ارزان‌تر براي اين مشكل مي‌باشد.
جدول ۴ ميزان توليد برخي از متابوليت‌هاي ثانويه را از طريق كاشت گياه كامل و كشت بآفت با هم مقايسه مي‌كند. همانطور كه مشاهده مي‌شود، ميزان توليد از طريق كشت بآفت ۱۰-۳ برابر بيشتر از كاشت گياه كامل مي‌باشد.
قيمت متابوليت‌هاي ثانويه نيز بسيار گران مي‌باشد، به طوري كه فروش محصولات دارويي مانند شيكونين (Shikonin) يا ديجي‌توكسين (Digitoxin) و يا عطرهايي همچون روغن جاسمين (Jasmin) از چند دلار تا چند هزار دلار به ازاي هر كيلو تغيير مي‌كند. به عنوان مثال قيمت هر كيلو از داروهاي ضد سرطان مانند وين‌بلاستين (Vinblastin)، وين‌كريستين (Vincristin) و تاگزول (Taxol) به چند هزار دلار مي‌رسد. جدول ۵ ميزان فروش جهاني برخي از متابوليت‌هاي ثانويه را بيان مي‌نمايد و هر كدام مبالغ هنگفتي را به خود اختصاص داده‌اند.
دید کلی[ویرایش]
فناوری نانو ، چنانکه از نام آن برمی‌آید با اجسامی به ابعاد نانومتر سروکار دارد. فناوری نانو در سه سطح قابل بررسی است: مواد ، ابزارها و سیستمها. در حال حاضر در سطح مواد ، پیشرفتهای بیشتری نسبت به دو سطح دیگر حاصل شده است. موادی را که در فناوری نانو بکار می‌روند، نانو ذره نیز می‌نامند. برای آنکه تصوری از ریزی نانو ذره‌ها داشته باشیم بهتر است آن را با ابعاد سلول مقایسه کنیم. اندازه متوسط سلول یوکاریوتی ۱۰ میکرومتر است. اندازه متوسط یک پروتئین۵ نانومتر است که با ابعاد ریزترین جسم ساخت بشر قابل مقایسه است. بنابراین می‌توان با بکارگیری نانو ذره‌ها نوعی مامور مخفی به درون سلول فرستاد و به کمک آن از بعضی رازهای نهفته در سلول پرده برداری کرد.
این ذرات آنقدر ریزند که تداخل عمده‌ای در کار سلول بوجود نمی‌آورند. پیشرفت در زمینه نانو فناوری نیازمند درک وقایع زیستی در سطح نانوهاست. از میان خواص فیزیکی وابسته به اندازه ذرات نانو ، خواص نوری (Optical) و مغناطیسی این ذرات ، بیشترین کاربردهای زیستی را دارند. استفاده از فناوری نانو در علوم زیستی به تولد گرایش جدیدی از این فناوری منجر شده است یعنی نانوبیوتکنولوژی. کاربردهای نانو ذره‌ها در زیست شناسی و پزشکی عبارتند از: نشانگرهای زیستی فلورسنت ، ترابری دارو و ژن ، تشخیص زیستی پاتوژنها ، تشخیص پروتئینها ، جستجو در ساختار DNA ، مهندسی بآفت ، تخریب تومور از طریق گرمادهی به آن و بهبود تباین (کنتراست).
رابطه نانوتکنولوژی و بیوتکنولوژی[ویرایش]
نانوتکنولوژی مجموعه‌ای است از فناوری هایی که به صورت انفرادی یا باهم در جهت بکارگیری و یا درک بهتر علوم مورد استفاده قرار می‌گیرند. بیوتکنولوژی جزء فناورهای در حال توسعه می‌باشد که با بکارگیری مفهوم نانو به پیشرفتهای بیشتری دست خواهد یافت.
نانوبیوتکنولوژی به عنوان یکی از حوزه‌های کلیدی قرن ۲۱ شناخته شده است که امکان تعامل با سیستم های زنده را در مقیاس مولکولی فراهم می‌آورد. بیوتکنولوژی به نانوتکنولوژی مدل ارائه می‌دهد، در حالی که نانوتکنولوژی با در اختیار گذاشتن ابزار برای بیوتکنولوژی آن را برای رسیدن به اهدافش یاری می‌رساند.
نشانگرهای زیستی[ویرایش]
از آنجا که انداه نانو ذرات ، در محدوده اندازه پروتئینهاست، می‌توان از آنها برای نشاندار کردن نمونه‌های زیستی استفاده کرد. برای این کار ، باید نانو ذره بتواند به نمونه زیستی هدف متصل شود و نیز راهی برای دنبال کردن و شناسایی نانو ذره وجود داشته باشد. به منظور ایجاد میان کنش بین نانو و نمونه زیستی ، نانو ذره را با پوشش بیولوژیکی مانند آنتی بادیها ، بیوپلیمرهایی مانند کلاژنها که نانو ذره ها را از نظر زیستی سازگار می‌کند، می‌پوشانند. می‌توان نانو ذره‌ها را فلورسنت کرده یا خواص نوری آنها تغییر داد.
نانو ذره‌ها در مرکز نشانگر زیستی قرار می‌گیرند و بقیه اجزا روی آنها قرار داده می‌شوند و این ساختار غالبا کروی است. کنترل دقیق بر اندازه متوسط ذرات امکان ایجاد کاوشگرهای فلورسنت را که باریکه‌های نوری را در طیف وسیعی از طول موج گسیل می‌دارند، فراهم می‌آورند. این امکان به تهیه نشانگرهای زیستی با رنگهای فراوان و قابل تشخیص ، کمک شایانی می‌کند. ذره مرکزی معمولا توسط چندین تک لایه از موادی که تمایل به واکنش ندارند مثل سیلیکا محافظت می‌شود.
مهندسی بآفت[ویرایش]
Tssue engeering
سطح استخوان از ترکیباتی تشکیل شده است که حدودا ۱۰۰ نانومتر عرض دارند. اگر سطح یک عضو مصنوعی به استخوان طبیعی پیوند بخورد بدن آن را پس می‌زند. دلیل امر تولید بآفت مصنوعی در محل استخوان طبیعی و سطح مصنوعی می‌باشد. استئوبلاستها در بآفت پیوندی استخوان وجود دارند و بخصوص در استخوانهای در حال رشد دارای فعالیت چشمگیری هستند. با ایجاد ذراتی در اندازه نانو در سطح مفاصل و استخوانهای مصنوعی احتمال دفع عضو جایگزین به دلیل تحریک سلولهای استئوبلاست کمتر می‌شود. ایجاد این ذرات با ترکیب مواد پلیمری ، سرامیکی و فلزی چندی پیش توسط دانشمندان به اثبات رسید.
مواد مورد استفاده در ترمیم استخوان
تیتانیوم ماده شناخته شده‌ای برای ترمیم استخوان است و به دلیل ترکیبات خاص و وزن زیادش جهت بالا بردن میزان استحکام بطور وسیع در دندانپزشکی و ارتوپدی استفاده می‌شود. ولی متاسفانه به دلیل آنکه بخش چسبنده‌ای که با Apatite (بخش فعال استخوان) پوشیده شده با تیتانیوم سازگار نیست فاقد فعالیت زیستی می‌باشد. استخوان واقعی نانوکامپوزیتی از موادی است که از ترکیب بلورهای هیدروکسید Apatite در ماتریکس آلی بوجود آمده و به حالت منفرد یآفت می‌شود. استخوان طبیعی از نظر مکانیکی ، ضخیم و در عین حال دارای الاستیسیته می‌باشد و در نتیجه قابل ترمیم است.
ساخت یک دندان
مکانیسم نانویی دقیقی که منجر به تولید ترکیباتی با خواص مفید شود، همچنان مورد مطالعه و بررسی قرار دارد. اخیرا با استفاده از روش tribology یک دندان مصنوعی به صورت viscoelastic ساخته شده و دارای روکش نانویی می‌باشد. از خواص منحصر به فرد این دندان مصنوعی می‌توان به عایق بودن آن در مقابل خراش و افزایش التیام دندان اشاره کرد.
معالجه سرطان به روش فتودینامیک
معالجه سرطان با استفاده از روش فتودینامیک بر اساس نابودی سلولهای سرطانی بوسیله لیزری است که تولید اکسیژن اتمی می‌کند. به این طریق که اکسیژن اتمی رنگ خاصی را تولید می‌کند و سلولهای سرطانی بیش از سلولهاهای دیگر آن را جذب می‌کنند. در نتیجه فقط سلولهای سرطانی توسط اشعه لیزر نابود می‌شوند. البته یکی از معایب این روش آن است که به دلیل آب گریز بودن مواد رنگی ، این مواد به سمت پوست و چشمها حرکت می‌کند و در صورتی که شخص در معرض نور خورشید قرار گیرد باعث حساسیت در پوست و چشمها می‌شود.
برای این حل مشکل صورتهای آب گریز مولکول رنگها را داخل ذرات نانویی متخلخل مثل ormosil nano partical که دارای منافذی در حدود یک نانومتر می‌باشند قرار می‌دهند که این دارای دو مزیت است اولا از انتقال مواد رنگی به سایر نقاط بدن جلوگیری می‌کنند و ثانیا امکان ورود و خروج آزادانه اکسیژن را مهیا می‌سازد.
کاربردهای اکسید تیتانیوم
اکسید تیتانیوم (Tio۲) می تواند به عنوان کاتالیزور نوری عمل نماید. هنگام تابش نور جذب فوتونها با انرژی بالا ، باعث برانگیختگی الکترونها و ایجاد رسانایی در مولکول می‌گردد. شکاف ایجاد شده بین دو جفت الکترون به مشابه یک جریان الکتروپوزیتیو در طول مولکول DNA باعث باز شدن دو رشته DNA از یکدیگر می‌گردد. در واقع تغییرات ایجاد شده بوسیله فوتونهای نور در مولکول Tio۲ باعث می‌شود که این مولکول به شکل یک آنزیم آندونوکلئاز عمل نماید. این تواناییها در آینده می‌تواند تغییرات زیادی را در استفاده از داروها و ژن درمانی ایجاد نماید و توانایی پیوند Tio۲ با بیومولکولهای مختلف راه را در ژن درمانی هموار خواهد نمود.
یکی از بزرگترین اشکالات دستکاری داخل سلول بوسیله این ریز ابزار این است که این ذرات به اندازه کافی توانایی کنترل ماده ژنتیکی داخل هسته را ندارند. ترکیب مولکول DNA با Tio۲ در محیط خارج سلول نشاندهنده این مشکل است. به ازای اتصال Tio۲ به هر ۶۰ - ۵۰ جفت باز فقط یک ناحیه ژنی در سلول •••••داران تحت پوشش قرار می‌گیرد که دانشمندان امیدوارند این مشکل نیز در آینده نزدیک حل شود. همچنین تحقیقاتی در زمینه استفاده از این ذرات به عنوان جایگزینی در توقف سنتز RNA به عنوان بازدارنده‌های سنتز RNA با مکانیزم ایجاد شکاف در RNA صورت گرفته که می‌تواند در صورت تکمیل شدن، امکان استفاده از این ذرات را در توقف سنتز RNA در سلولهای سرطانی فراهم نماید.
چشم انداز بحث[ویرایش]
با توجه به پیشرفت سریع و دامنه گسترده بیوتکنولوژی زمینه‌های بروز انقالاب بیوتکنولوژی عصر جدیدی در علوم مختلف مانند بیولوژی ، پزشکی ، فارماکولوژی و مهندسی ژنتیک فراهم گردیده است. به علاوه حوزه‌های دیگری مانند اقتصاد و سیاست نیز از آن تاثیر بسزایی پذیرفته است. هم اکنون از دیدگاه اخلاق زیستی در این رابطه سوالات مهم و اساسی مطرح شده است که علاوه بر اثرات بسزایی که بر پیشرفتهای علمی و سایر زمینه‌های علوم زیستی دارد، نسلهای آینده بشر را نیز به صورت گسترده‌ای تحت‌الشعاع قرار می‌دهد. در این باره مشارکت مداوم دانشمندان کنجکاو و خردمندی می‌تواند راه گشا بوده و بایستی با در نظر گرفتن این منابع و پیشرفتهای جدید و با امید به حل چنین مشکلات و مسائلی با فائق آمدن بر همه محدودیتها در جهت گسترش این دانش فعالیت نمود.
مزایای کشت گرده نسبت به کشت بساکافزایش شانس باززایی گیاهان هاپلویید در کشت دانه گردهü
با حذف بساک مواد بازدارنده رشد و آبسزیک اسید حذف می شوند.ü
در کشت دانه گرده ، بساک ها به عنوان مانع انتقال موادü غذایی از محیط کشت به دانه گرده نمی توانند اثری داشته باشند.
امکان بروز شیمر در کشت دانه گرده کمتر استوü
برای القای موتاسیون و دست ورزی هایü ژنتیکی کشت دانه گرده مهم تر از کشت بساک می باشد.
تشکیل جنین در کشت دانه گرده راحت تر و بهتر از کشت بساک است.ü
کاربرد های هاپلوئید ها[ویرایش]
امکان رسیدن سریع به هموزیگوسیتی با ایجاد دبل هاپلوئید فراهم می شود.
امکان رسیدن سریع به هموزیگوسیتی در گیاهان در گیاهان با دوره گلدهی طولانی فراهم می شود.
.امکان تولید هیبرید های F۱ یکنواخت فراهم می شود.
حصول هاپلوئیدی به منظور آسان کردن مطالعات توارث و خصوصیات مطلوب
تولید گیاهان نر در باغبانی امکان پذیر می شود. مثلا در مارچوبه عملکرد بوته های نر بیشتر است.
برای انجام هیبریداسیون سوماتیکی ، کار کردن با پروتوپلاست های هاپلوئید راحت تر از کار کردن با پروتوپلاست های دیپلوئید می باشد.
استفاده از تنوع سوماکلونال اتفاق افتاده در کشت بافت و ایجاد گیاهانی مقاوم به حشرات و ...
کشت تخمک[ویرایش]
برای تولید گیاهاان هاپلوئید در گونه هایی که با کشت دانه گرده نتایج نامطلوبی چون آلبینیسم را به همراه دارد، یا مانند ژربرا با نارسایی همراه است، می توان از کشت تخمک یا تخمدان بهره گرفت. برای تولید گیاه هاپلوئید با استفاده از کشت تخمدان ، تخمک های بارور نشده جوانه گل ، ۲۴ الی ۴۸ ساعت قبل از گرده افشانی طبیعی جدا می شوند.قبل از کشت بخش انتهایی دمگل بریده می گردد وتخمدانرا از سمت بریده شده در محیط کشت قرار می دهند.
در کشت تخمدان معمولا از محیط کشت های وایت و نیچ و یا N۶ استفده می کنند .مهمترین عیبی که این تکنیک دارد اینست که نسبت به کشت میکروسپور که تعداد بیشماری دانه گرده دارد، در هرگل فقط یک تخمدان وجود دارد..
کشت پروتوپلاست[ویرایش]
در این کشت، پروتوپلاست جدا شده و در شرایط درون شیشه ای کشت می شود معمولا از سلول های مزوفیل برگ استفاده می شود در برخی از موارد از کشت سوسپانسیون سلولی برای تولید پروتوپلاست استفاده می گردد.در این صورت سلول ها در مرحله رشد تصاعدی برداشت می شوند. پس از انتخاب سلول ها ، دیواره سخت سلولزی را از بین می برند به منظور خالص کردن پروتوپلاست ها از ••••• ها و سپس برای ته نشین کردن پروتوپلاست ها از سانتریفیوژ استفاده می کنند ( سانتریفیوژ مکرر با دور کم و در محلول ساکاروز ۱۵ الی ۲۰ درصد انجام می شود) سپس پروتوپلاست های جدا شده به منظور واکشت در محیط کشت جدیدی قرار داده می شوند.لازم به ذکر است که در محیط کشت نباید از آمونیوم استفاده کرد چون بقای پروتوپلاست را به مخاطره می اندازد. مقدار کلسیم در محیط کشت افزوده و از مقدار آهن و روی کاسته می گردد.معمولا غلظت اکسین را بالا تر و سیتو کینین را کم تر می کنند و محیط کشت را در تاریکی قرار می دهند.
امتزاج پروتوپلاست[ویرایش]
یکی از مهمترین استفاده های کشت پروتوپلاست استفاده از آن در دو رگ های سوماتیکی و امتزاج پروتوپلاست است.
معمولا به منظور امتزاج پروتوپلاست ها ، دو گونه از طریق انکوباسیون پروتوپلاست ها در غلظت بالای PEG و در غلظت بالای کلسیم و همچنین محیطی قلیایی انجام می گیرد. به دلیل وجود بار های منفی در سطح پروتوپلاست دو گونه مختلف معمولا امتزاج آنها به سختی انجام می شود.که برای جلوگیری از این امر از موادی موسوم به فوزیژن ها ( شامل نیترات سدیم و کلرید کلسیم) استفاده می شود.ممکن است از روش الکتروفیوژن استفاده شود که در این روش ابتدا با شدت جریان کم، ابتدا پروتوپلاست ها به هم اتصال پیدا می کنند سپس با افزایش شدت در زمان کم ، عمل امتزاج روی می دهد.
پس از عمل امتزاج نوبت به باز زایی دیواره سلولی پروتوپلاست هیبرید می شود.بدین منظور باید غلظت کلسیم در محیط کشت را زیاد و پتانسیل اسمزی را کم کنیم.. بعد از چند روز که دیواره سلولی باز زایی شد ، پتانسیل اسمزی را به تدریج افزایش می دهیم تا به حد نرمال برسد. اگر پروتوپلاست ها از دو ژنوتیپ مختلف با هم ، امتزاج یابند هتروکاریون و اگر دو پروتوپلاست مشابه با هم امتزاج یابند، هوموکاریون حاصل می شود.
سیبرید ها[ویرایش]
امتزاج بین هسته و سیتوپلاسم یک گونه با فقط سیتو پلاسم پروتوپلاست دیگر را سیبرید گویند. در ایجاد نر عقیمی ، مقاومت به بیماری و مقاومت به علفکش ها استفاده می شود
انواع کشت سوسپانسیون سلولی
کشت بستهv
کشت مداوم که خود شامل دو دسته می شود:v
کشت مداوم باز
کشت مداوم بسته
کشت بسته:
در این روش محیط کشت تجدید نمی شود.
کشت مداوم باز :
در این نوع سیستم محیط کشت تجدید می شود و همزمان با تجدید محیط کشت سلول ها هم برداشت می شوند.
سیستم کموستات : در این سیستم با ثابت نگه داشتن نیتروژن ، فسفر و گلوکز، مقدار رشد وتراکم سلول ثابت نگه داشته می شود و سایر مواد در حد متعادل نگه داشته می شوند.
سیستم توربیدوستات : در این سیستم ، محیط کشت با توجه به میزان کدری آن ، جایگزین می شود و تراکم سلول با استفاده از برداشت سلول ها از محیط کشت ثابت نگه داشته می شود.
محیط کشت مداوم بسته:
در این حالت محیط کشت تجدید می شود ولیکن سلول ها برداشت نمی شوند.
همزمان سازی کشت سوسپانسیون سلولی به منظور تولید متابولیت های ثانویه
یک کشت همزمان کشتی است که در آن کل چرخه سلولی و یا یک مرحله خاصی از چرخه سلولی اکثر سلول ها همزمان اتفاق می افتد. این همزمان کردن سبب یکنواختی رشد سلول ها می شود . روش زیر برای ایجاد همزمانی در کشت سوسپانسیون سلولی توصیه می شود:
سرما دادن: قرار دادن محیط کشت در یخچال به مدت چند روز.§
گرسنگی دادن : کاهش دادن یا قطع یک فاکتور ضروری رشد که منجر به ایجاد§ فاز سکون می شود و سپس فراهم کردن مجدد همان فاکتور که موجب همزمانی مراحل رشد سلولی می گردد.
استفاده از بازدارنده های شیمیایی مثل هیدروکسی اوره و ...§
استفاده از موادی نظیر کلشی سین که منجر به توقف رشد سلول ها در مرحله§ متافاز می شود.
تکنیک کشت تک سلول ( تکنیک برگمن در محیط کشت جامد)
برگمن در سال۱۹۶۰ برای اولین بار پخش سلول های کشت سوسپانسیون بر سطح محیط کشت آگار را ابداع کرد. در این روش سوسپانیون سلولی و آگار ، به طور جداگانه و هر یک با غلظت دو برابر تهیه می شود سپس مقادیر مساوی از سوسپانسیون سلولی و آگار در دمای ۳۸ درجه سانتیگراد با هم ترکیب و سریعا به پتری دیش منتقل می شوند. به نحوی که سلول ها در لایه نازکی به ضخامت یک میلیمتر، پخش می شوند.
سوسپانسیون سلولی محیط کشت برگمن باید حتما رقیق باشد و پس از آن ظرف شیشه ای را با پارافین بسته و پتری دیش را در دمای ۲۵ درجه سانتیگراد به مدت سه هفته درون انکوباتور قرار می دهیم.
کاربرد های کشت سوسپانسیون سلولی
امکان تکثیر گیاهان مشابه را فراهم می کندü
از این نوع کشت جهت مطالعه و تحقیق بر روی سلول ها استفده فراوانی میü شود.
از تنوع سوماکلونال اتفاق افتاده در کشت سوسپانسیون سلولی جهت تولیدü گیاهانی با خصوصیات جدید بهره می برند.
ü منبعی برای تولید متابولیت های ثانویه به شمار می آیند.
متابولیت های ثانویه
موادی هستند که مورد استفاده گیاهان واقع نمی شوند و نیز وارد سیکل های حیاتی گیاه وارد نمی شوندو اصلا فعالیت فیزیولوژیکی در گیاه انجام نمی دهند اما به منظور دفع آفات ، جذب حشرات و مبارزه با بیماری های گیاهی تولید می شوند.
بیوترانسفورماسیون
تغییر و تبدیل یک ماده بی ارزش به یک ماده مهم صنعتی با استفاده از سیستم های بیولوژیکی (کشت بافت و کشت سوسپانسیون سلولی) را بیوترانسفورماسیون گویند. سلول های گیاهی معمولا به دو روش در بیوترانسفورماسیون مورد استفاده قرار می گیرند:
۱. استفاده از کشت سوسپانسیون سلولی و اضافه نمودن ماده بی ارزش به محیط کشت و سپس برداشت محصول از محیط کشت پس از مدت زمان مناسب.
۲. بی تحرک کردن سلول های گیاهی ( تثبیت سلول ها ) در ستون های حاوی ماتریکس ژله مانند ( جنس این ژل آلژینات سدیم یا پتاسیم است ). سوبسترا یا ماده بی ارزش از بخشی وارد ماتریکس می گردد و از طرفی دیگر ماده مورد نظر استخراج می شود.
مهم ترین واکنش هایی که سلول های گیاهی در بیوترانسفورماسیون انجام می دهند عبارست از: هیدروکسیلاسیون ، اکسیداسیون و احیا ، هیدرولیز ، گلیکولیزاسیون ، ایجاد باند مضاعف.
تولید گیاهان هاپلوئید با استفاده از کشت بساک و کشت تخمک
روش تولید گیاهان هاپلوئید در شرایط برون شیشه ای با استفاده از عوامل زیر صورت می گیرد:
• بکرزایی
• نرزایی یا آندروژنز
• حذف ژنوم در تلاقی های دور
• سمی گامی
• تیمار شیمیایی مثل کلشیسین،مائیک هیدرازید و...
• درجه حرارت های بالا و پایین
• اشعه ایکس و ماورا بنفش
تولید گیاهان هاپلوئید در شرایط درون شیشه ای با استفاده از عوامل زیر صورت می گیرد:
• کشت بساک
• کشت دانه گرده
• کشت گل آذین
• کشت تخمک
• کشت جنین
کشت بساک
جداسازس بساک و استریل نمودن و قرار دادن آن بر روی محیط کشت را کشت بساک می نامند.بساک به عنوان ریز نمونه هنگامی جدا می شود که اولین تقسیم میتوز در دانه گرده رخ نداده است. و یا اینکه بساک دارای میکروسپور های تک هسته ای بین باشند.گیاهان هاپلوئید را می توان به دو روش از بساک های استریل تولید نمود. یکی روش مستقیم و دیگری روش غیر مستقیم. در روش مستقیم از دانه گرده ، مستقیما جنین به دست می آید .در روش غیر مستقیم ابتدا از دانه گرده کالوس تولید می شود سپس جنین یا ساقه نابجا تولید می شود. لازم به ذکر است که روش غیر مستقیم به دلیل تولید سطوح مختلف پلی پلوئیدی روش مناسبی نمی باشد.
کشت دانه گرده:
جداسازی دانه گرده ( میکروسپور ) از درون بساک و کشت آن در شرایط درون شیشه را کشت دانه گرده گویند. روش جدا سازی دانه گرده از بساک کمی مشکل است و شامل مراحل زیر است:
Ø ابتدا بساک ها را در مرحله مناسب جدا می کنند و با یک میله شیشه ای خمیده له می کنند. در این حالت دانه های گرده از بساک خارج می شوند.
Ø در این مرحله سوسپانسیون بساک ها به همراه دانه های گرده از صافی گذرانده می شوند.( قطر منافذ این صافی کمی بیش تر از قطر دانه گرده است)
Ø سوسپانسیون محتوی دانه گرده با دور کم ۱۵۰ به مدت ۵ دقیقه سانتریفیوژ می شوند.و فاز رویی که محتوی مواد زاید می باشد به دور ریخته می شود.
Ø دانه های گرده رسوب کرده بر روی یک محیط کشت مناسب قرار داده می شوند. در نهایت سوسپانسیون حاصل با پیپت به پتری دیش منتقل می شود.
عوامل موثر در در موفقیت کشت دانه گرده و بساک
o ژنوتیپ گیاه
o وضعیت فیزیولوژیکی گیاه والدی که از آن ریز نمونه گرفته می شود.
o مرحله رشد دانه گرده در هنگام جداسازی
o پیش تیمار بساک ها که شامل پیش تیمار سرمایی و پیش تیمار گرمایی و یا پیش تیمار شیمیایی می شود.
o محیط کشت که معمولا از درصد بالایی ، قند، گلوتامین ، نیترات و نمک ها آمونیومی ، ذغال فعال ، آهن و ... تشکیل شده است.
پیوندها[ویرایش]
بانک مقالات کشاورزی
